Evolutionary Methods in Biotechnology : Clever Tricks for Directed Evolution.

1 Introduction Susanne Brakmann and Andreas Schwienhorst . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 Generation of Mutant Libraries Using Random Mutagenesis Susanne Brakmann and Björn F. Lindemann . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 2.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 2.2.1 Materials for Random PCR Mutagenesis . . . . . . . . . . 6 2.2.2 Materials for Mutator Strain Passage . . . . . . . . . . . . 6 2.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 2.3.1 Protocol for Random PCR Mutagenesis According to Joyce 7 2.3.2 Protocol for Mutator Strain Passage . . . . . . . . . . . . 8 2.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 3 DNA Shuffling Hikaru Suenaga, Masatoshi Goto, and Kensuke Furukawa . . . . . . . . . . 13 3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 3.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 3.2.1 For Preparation of Parental Genes . . . . . . . . . . . . . . 15 3.2.2 For Random Fragmentation by DNase I . . . . . . . . . . 15 3.2.3 For Collection of DNA Fragments in Specific Molecular Size Ranges . . . . . . . . . . . . . 16 3.2.4 For Reassembly of These Fragments by Primerless PCR . 16 3.2.5 For Amplification of Reassembled Products by Conventional PCR with Primers . . . . . . . . . . . . . 16 3.3 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 3.3.1 Preparation of Parental Genes . . . . . . . . . . . . . . . . 17 3.3.2 Random Fragmentation by DNase I . . . . . . . . . . . . . 17 3.3.3 Collection of DNA Fragments in Specific Molecular Size Ranges . . . . . . . . . . . . . 18 3.3.4 Reassembly of These Fragments by Primerless PCR . . . 19 3.3.5 Amplification of Reassembled Products by Conventional PCR with Primers . . . . . . . . . . . . . 20 VI Contents 3.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 3.4.1 Insufficient DNase I Fragmentation . . . . . . . . . . . . . 21 3.4.2 Little or No Product of Primerless PCR . . . . . . . . . . 21 3.4.3 Little or No Product of PCR with Primers . . . . . . . . . 21 3.4.4 The Product of PCR with Primers is Multi-banded . . . . 22 3.5 Amplification Examples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 4 DNA Recombination Using StEP Milena Ninkovic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 4.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 4.2.1 StEP PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 4.2.2 Purification of an Appropriate DNA Fragment . . . . . . 27 4.2.3 Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 4.3 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 4.4 Technical Tips . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 4.4.1 Problem: Little or No PCR Product (Full-length Product) after PCR . . . . . . . . . . . . . . . 28 4.4.2 Problem: High Background Levels of DNA after PCR . . 28 4.5 StEP in Directed Evolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 5 FACS Screening of Combinatorial Peptide and Protein Libraries Displayed on the Surface of Escherichia coli Cells Thorsten M. Adams, Hans-Ulrich Schmoldt, and Harald Kolmar . . . . . . . 31 5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 5.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 5.2.1 Escherichia coli Strains and Plasmids . . . . . . . . . . . 35 5.2.2 Liquid Media and Agar Plates . . . . . . . . . . . . . . . . 35 5.2.3 Biological and Chemical Materials . . . . . . . . . . . . . 36 5.2.4 Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 5.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 5.3.1 Verification of Cell Surface Exposure of the Passenger Protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 5.3.2 Labeling of the Target Protein . . . . . . . . . . . . . . . . 37 5.3.3 Library Construction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 5.3.4 Combinatorial Library Screening by FACS and MACS . . 40 5.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42 5.5 Major Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 6 Selection of Phage-displayed Enzymes Patrice Soumillion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 6.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 6.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 Contents VII 6.2.1 Buffers, Reagents and Consumables . . . . . . . . . . . . 50 6.2.2 Strains and Vectors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 6.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 6.3.1 The Phage-enzyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 6.3.2 Library Construction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 6.3.3 Selection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 6.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62 6.4.1 Phage Titers Are Not Reproducible . . . . . . . . . . . . . 62 6.4.2 Phage-enzymes Degrade with Time . . . . . . . . . . . . . 63 6.4.3 Phages Are Not Genetically Stable . . . . . . . . . . . . . 63 6.4.4 The ‘out/in’ Ratio Does Not Increase with Selection Rounds 63 6.5 Major Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 7 Selection of Aptamers Heiko Fickert, Heike Betat, and Ulrich Hahn . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 7.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 7.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 7.2.1 Immobilization of Target Molecules . . . . . . . . . . . . 66 7.2.2 PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 7.2.3 In vitro Transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 7.2.4 RNA Purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 7.2.5 Selection of Aptamers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 7.2.6 Reverse Transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 7.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 7.3.1 Selection of RNA Aptamers . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 7.3.2 Selection of 2-Modified RNA Aptamers . . . . . . . . . . 75 7.3.3 Selection of ssDNA Aptamers . . . . . . . . . . . . . . . . 76 7.3.4 Cloning and Sequencing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 7.3.5 Characterization of Aptamers . . . . . . . . . . . . . . . . 77 7.3.6 Example: Isolation of Moenomycin A-specific Aptamers 79 7.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 7.5 Major Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83 8 Methods for Selecting Catalytic Nucleic Acids Benjamin L. Holley, and Bruce E. Eaton . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 8.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 8.2 Materials and Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 8.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91 8.3.1 Generating the Starting Library . . . . . . . . . . . . . . . 91 8.3.2 Transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 8.3.3 Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99 8.3.4 Nucleic Acid-catalyzed Reactions . . . . . . . . . . . . . . 102 8.3.5 Reverse Transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104 VIII Contents 8.3.6 Partitioning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 8.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108 8.5 Major Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109 9 High-throughput Screening of Enantioselective Industrial Biocatalysts Manfred T. Reetz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 9.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113 9.2 Materials and Equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115 9.2.1 Assays Based on Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . 115 9.2.2 Assays Based on NMR Spectrometry . . . . . . . . . . . . 116 9.2.3 Assay Based on FTIR Spectroscopy . . . . . . . . . . . . 116 9.2.4 Assays Based on UV/Visible Spectroscopy . . . . . . . . 116 9.2.5 Enzyme-coupled UV/Visible-based Assay for Hydrolases 117 9.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117 9.3.1 Assays Based on Mass Spectrometry . . . . . . . . . . . . 117 9.3.2 Assays Based on NMR Spectroscopy . . . . . . . . . . . . 121 9.3.3 Assay Based on FTIR Spectroscopy . . . . . . . . . . . . 125 9.3.4 Assays Based on UV/Visible Spectroscopy . . . . . . . . 129 9.3.5 Enzyme-coupled UV/Visible-based Assay for Hydrolases 132 9.3.6 Further Assays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133 9.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138 9.4.1 Comments on the Kazlauskas Test . . . . . . . . . . . . . 138 9.4.2 Potential Problems when Performing Kinetic Resolution . 138 9.5 Conclusions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139 10 Computer-assisted Design of Doped Libraries Dirk Tomandl and Andreas Schwienhorst . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 10.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143 10.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146 10.3 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147 10.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150 10.5 Major Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151 11 Directed in silico Mutagenesis Markus Wiederstein, Peter Lackner, Ferry Kienberger, Manfred J. Sippl . . . 153 11.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153 11.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155 11.2.1 PDB Files . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155 11.2.2 Knowledge-based Potentials . . . . . . . . . . . . . . . . . 156 11.2.3 Polyprotein, Z-scores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160 11.2.4 In silico Mutagenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162 11.2.5 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 Contents IX 11.3 Protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 11.3.1 ProSa Setup and Interaction . . . . . . . . . . . . . . . . . 163 11.3.2 ProSa Objects . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164 11.3.3 Session 1 (mut script1.cmd) . . . . . . . . . . . . . . 164 11.3.4 Session 2 (mut script2.cmd) . . . . . . . . . . . . . . 166 11.3.5 Session 3 (mut script3.cmd) . . . . . . . . . . . . . . 168 11.3.6 Session 4 (mut script4.cmd) . . . . . . . . . . . . . . 170 11.3.7 Tips & Tricks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171 11.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173 11.5 Major Applications . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175 12 RNA Folding in silico Christoph Flamm, Ivo L. Hofacker, Peter F. Stadler . . . . . . . . . . . . . . 177 12.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177 12.2 Materials . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178 12.2.1 Typographical Conventions . . . . . . . . . . . . . . . . . 179 12.2.2 RNA Web Services . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180 12.3 Protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181 12.3.1 Secondary Structures for Individual Sequences . . . . . . 181 12.3.2 Consensus Structures of a Sample of Sequences . . . . . . 183 12.3.3 Sequence Design . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184 12.3.4 Analysis of SELEX Experiments . . . . . . . . . . . . . . 186 12.3.5 A Note for the Experts: Write your Own RNA Programs . 187 12.4 Troubleshooting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 187 12.5 Caveats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189 13 Patenting in Evolutionary Biotechnology Martina Leimkühler and Hans-Wilhelm Meyers . . . . . . . . . . . . . . . . 191 13.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191 13.2 The Nature of Patents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191 13.3 What Can Be Patented . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192 13.4 The Requirement of Novelty . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193 13.5 The Requirement of Inventiveness . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196 13.6 The Requirement of Utility . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197 13.7 The Requirements of Enablement and Written Description . . . . 197 13.8 Patent Prosecution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199 13.9 Search Tools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204 13.10 The First-to-invent Principle of the United States and Its Consequences on Laboratory Notebook Keeping . . . . . 206 13.11 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209 Subject Index . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211